目前，药(yao)(yao)用抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)研发(fa)主要(yao)基于(yu)杂交瘤细(xi)胞或者体(ti)(ti)(ti)(ti)外抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)库。通过(guo)(guo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原设计(ji)和(he)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)筛(shai)(shai)选(xuan)，人们(men)初步(bu)获得(de)阳(yang)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)hits，再进(jin)一步(bu)通过(guo)(guo)一系列(lie)生物性(xing)(xing)质(zhi)检测(ce)和(he)功能验证，最终(zhong)得(de)到(dao)有(you)药(yao)(yao)用潜(qian)力(li)(li)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)。在实际研发(fa)过(guo)(guo)程(cheng)中，经过(guo)(guo)了常规筛(shai)(shai)选(xuan)所得(de)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)，有(you)诸(zhu)多(duo)(duo)方面需要(yao)更细(xi)致的(de)(de)(de)改进(jin)，包括亲(qin)(qin)和(he)力(li)(li)、免疫原性(xing)(xing)、半衰期等等，抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)领域这些年来做了很(hen)多(duo)(duo)相(xiang)关(guan)的(de)(de)(de)研究(jiu)和(he)实践(jian)。其中，抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)亲(qin)(qin)和(he)力(li)(li)成熟是研究(jiu)的(de)(de)(de)重要(yao)方向之一。理论上，抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)亲(qin)(qin)和(he)力(li)(li)的(de)(de)(de)提(ti)高有(you)助(zhu)(zhu)于(yu)改善抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)特(te)异性(xing)(xing)和(he)效(xiao)(xiao)力(li)(li)，有(you)助(zhu)(zhu)于(yu)减(jian)少用药(yao)(yao)剂量，降(jiang)低毒(du)副(fu)作(zuo)用等。虽然实际的(de)(de)(de)研究(jiu)工作(zuo)证明亲(qin)(qin)和(he)力(li)(li)的(de)(de)(de)提(ti)高与抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)效(xiao)(xiao)价的(de)(de)(de)提(ti)高并不总是线(xian)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)关(guan)系，尤其在实体(ti)(ti)(ti)(ti)瘤的(de)(de)(de)治(zhi)疗上（可(ke)参考Weinstein的(de)(de)(de)“binding site barrier”假说[1]），但很(hen)多(duo)(duo)情(qing)况下，这个(ge)线(xian)性(xing)(xing)关(guan)系是明显(xian)存在的(de)(de)(de)。另外，发(fa)展(zhan)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)亲(qin)(qin)和(he)力(li)(li)成熟的(de)(de)(de)技术(shu)，不仅有(you)助(zhu)(zhu)于(yu)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)药(yao)(yao)物的(de)(de)(de)研发(fa)和(he)质(zhi)量改善，同时(shi)也有(you)助(zhu)(zhu)于(yu)人们(men)更好地理解抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)体(ti)(ti)(ti)(ti)与靶点相(xiang)互作(zuo)用的(de)(de)(de)机(ji)理，更好地认识靶点的(de)(de)(de)功能。
本文中(zhong)，小(xiao)编就(jiu)与(yu)大家(jia)分享自己对抗体亲(qin)和(he)力成熟技(ji)术的简单总结。本文涉(she)及的技(ji)术内容整理如下，之后的行(xing)文将围绕这个提纲展开：
1. 模拟体细胞高频突变的抗体亲和力成熟策略
BCR基(ji)因重(zhong)排后的(de)成熟(shu)B细(xi)(xi)胞受到抗(kang)原刺激后，会于(yu)生(sheng)发(fa)中心(xin)发(fa)生(sheng)重(zhong)链和(he)轻链V区的(de)高频率突变(bian)（主要是(shi)点突变(bian)），之后再(zai)经(jing)过FDC捕获抗(kang)原使表达高亲和(he)力(li)BCR的(de)B细(xi)(xi)胞免于(yu)凋亡。这一过程使得后代B细(xi)(xi)胞的(de)BCR对(dui)抗(kang)原的(de)平(ping)均亲和(he)力(li)得到提升。这样(yang)的(de)体(ti)细(xi)(xi)胞高频突变(bian)属于(yu)二次(ci)免疫应答，帮助可有效识别抗(kang)原的(de)抗(kang)体(ti)进(jin)一步(bu)成熟(shu)，有助于(yu)机体(ti)有效抵抗(kang)外来抗(kang)原的(de)再(zai)次(ci)入侵(qin)。
抗体亲和力成熟的策(ce)略之(zhi)一，就(jiu)是(shi)模拟体细胞(bao)高频突变，通过细胞(bao)突变和展示(shi)抗体蛋白筛(shai)选对抗原高亲和的抗体。
1.1 基于B细胞系（人、鸡等）高频突变的筛选策略
Ramos是来(lai)源于人Burkitt淋(lin)巴瘤的(de)(de)一株细(xi)(xi)胞(bao)系(xi)，在(zai)培养过(guo)程(cheng)中(zhong)其重排后(hou)(hou)的(de)(de)免疫球蛋白V区基因持续(xu)发生(sheng)组成型突变，并(bing)表达到膜(mo)表面。早(zao)在(zai)2002年Sarah等人就(jiu)报道了利用Ramos细(xi)(xi)胞(bao)系(xi)筛选出(chu)对(dui)链霉(mei)(mei)亲(qin)和(he)素(su)有(you)高(gao)(gao)亲(qin)和(he)力的(de)(de)IgM[2]。他(ta)们(men)将链霉(mei)(mei)亲(qin)和(he)素(su)结(jie)合(he)到磁珠上，从(cong)一群(qun)Ramos细(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)筛出(chu)对(dui)链霉(mei)(mei)亲(qin)和(he)素(su)有(you)低亲(qin)和(he)力的(de)(de)细(xi)(xi)胞(bao)群(qun)，之后(hou)(hou)降(jiang)低磁珠上的(de)(de)链霉(mei)(mei)亲(qin)和(he)素(su)的(de)(de)密度以(yi)提高(gao)(gao)筛选的(de)(de)苛(ke)刻程(cheng)度，进一步筛出(chu)亲(qin)和(he)力更高(gao)(gao)的(de)(de)突变。之后(hou)(hou)又进一步用标(biao)记(ji)FITC荧光的(de)(de)链霉(mei)(mei)亲(qin)和(he)素(su)结(jie)合(he)流(liu)式分选将抗体(ti)亲(qin)和(he)力进一步提高(gao)(gao)。
随后，他们对(dui)各批次的(de)(de)亚克隆细胞的(de)(de)V区基(ji)因做了序列比对(dui)，找出了突变位点，分析了抗体(ti)与靶点之间的(de)(de)构效关系：
同在这篇(pian)文章中，他们(men)还尝试了使用XRCC2缺失的(de)鸡来源(yuan)的(de)B细胞系(xi)（DT40），筛选针对(dui)多个(ge)抗原的(de)高(gao)亲和力IgM。该(gai)细胞系(xi)同样具有高(gao)频率(lv)的(de)V区(qu)基因(yin)组成(cheng)型突变，并(bing)且比Ramos细胞系(xi)增(zeng)殖时(shi)间(jian)更短。筛选结(jie)果(guo)显示该(gai)细胞系(xi)也(ye)能(neng)实现IgM的(de)亲和力成(cheng)熟。
以(yi)上两个(ge)例子(zi)(zi)说明合适的(de)B细(xi)胞(bao)(bao)系可以(yi)作为(wei)工具细(xi)胞(bao)(bao)，用(yong)于(yu)抗体(ti)(ti)的(de)亲和(he)力成熟。在具体(ti)(ti)应用(yong)中，可以(yi)将特(te)定的(de)抗体(ti)(ti)模(mo)板基(ji)(ji)因插到细(xi)胞(bao)(bao)的(de)免疫球蛋(dan)白基(ji)(ji)因位点(dian)，然后进行(xing)细(xi)胞(bao)(bao)培养和(he)高亲和(he)力细(xi)胞(bao)(bao)群的(de)筛(shai)选。但基(ji)(ji)于(yu)体(ti)(ti)细(xi)胞(bao)(bao)高频(pin)突(tu)变(bian)的(de)抗体(ti)(ti)亲和(he)力成熟技术有(you)一(yi)定的(de)缺陷，至少包括两点(dian)：一(yi)是体(ti)(ti)细(xi)胞(bao)(bao)高频(pin)突(tu)变(bian)过程中每(mei)个(ge)密码子(zi)(zi)中通常只有(you)一(yi)个(ge)碱(jian)基(ji)(ji)发生突(tu)变(bian)，这严重制约了突(tu)变(bian)后的(de)库的(de)多样性；二是由于(yu)快速的(de)内部化效应，BCR的(de)亲和(he)力往往会遇到天花板（KD值很难达到0.1 nM以(yi)下）。
1.2 基于其他细胞高频突变的策略研究
基于(yu)体(ti)细胞(bao)(bao)高频突(tu)变(bian)的(de)抗体(ti)亲(qin)(qin)和力成熟的(de)开发，主流(liu)方法均是基于(yu)B细胞(bao)(bao)系(xi)(xi)。B细胞(bao)(bao)系(xi)(xi)有(you)其自身的(de)不足，如(ru)基因操(cao)作(zuo)比较困(kun)难、蛋(dan)(dan)白的(de)翻译后修饰特(te)点不能满足所有(you)外源蛋(dan)(dan)白的(de)要求等(deng)等(deng)。于(yu)是有(you)实验室尝试在(zai)非(fei)B细胞(bao)(bao)系(xi)(xi)统上实现亲(qin)(qin)和筛(shai)选，以扩充该技术的(de)细胞(bao)(bao)系(xi)(xi)选择面。如(ru)中科院生物(wu)物(wu)理(li)所杭海英(ying)课题组，向人非(fei)小(xiao)细胞(bao)(bao)肺(fei)癌(ai)细胞(bao)(bao)系(xi)(xi)H1299中导(dao)入激活诱导(dao)的(de)胞(bao)(bao)苷(gan)脱氨酶（AID），构建(jian)H1299-AID稳(wen)(wen)转(zhuan)株，然(ran)后进(jin)一(yi)步导(dao)入抗TNF-α的(de)scFv基因并(bing)构建(jian)稳(wen)(wen)转(zhuan)株，得到的(de)稳(wen)(wen)转(zhuan)株进(jin)行培养和流(liu)式分(fen)选，获取高亲(qin)(qin)和力的(de)scFv[3]。
除此之(zhi)外(wai)，还有基(ji)于非(fei)真核系统的筛(shai)选方(fang)法，如利用E. Coli的基(ji)因(yin)增变株来(lai)实现抗体基(ji)因(yin)的高频突变等等，其原理(li)大同小异。
2. 基于抗体库的亲和力成熟策略
基于抗(kang)(kang)体(ti)库(ku)的抗(kang)(kang)体(ti)亲和(he)力(li)成(cheng)熟与(yu)基于抗(kang)(kang)体(ti)库(ku)的抗(kang)(kang)体(ti)筛选并无本质(zhi)差别，均为体(ti)外(wai)高(gao)亲和(he)力(li)抗(kang)(kang)体(ti)筛选，重点仍是(shi)两个(ge)方面，即(ji)库(ku)的构(gou)建和(he)筛选系统的选择。区别在于，后者所用的库(ku)在构(gou)建或合成(cheng)时无偏向(xiang)性或只具有针对(dui)某抗(kang)(kang)原的有限的偏向(xiang)性；而前(qian)者所用的库(ku)是(shi)基于确定的抗(kang)(kang)体(ti)序列模板所构(gou)建的。
2.1 建库策略
建库(ku)的策略可分(fen)为两个大的类别(bie)：一(yi)类是构(gou)建较(jiao)大的库(ku)，将(jiang)抗体CDR区域(yu)甚至整个V区做随机突变(bian)；另(ling)一(yi)类是构(gou)建较(jiao)小(xiao)的库(ku)，将(jiang)突变(bian)集中(zhong)于抗体序列上特定的区域(yu)。
大(da)(da)库构(gou)(gou)建的(de)方法主要有(you)CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是(shi)(shi)指分段随机突变并(bing)保(bao)证相邻(lin)两个(ge)突变区(qu)(qu)域有(you)所(suo)重(zhong)叠，从而使(shi)突变覆盖整个(ge)CDR区(qu)(qu)域；chain shuffling是(shi)(shi)将抗(kang)(kang)体(ti)的(de)VH和VL的(de)配(pei)对重(zhong)新洗牌，而DNA shuffling则是(shi)(shi)将抗(kang)(kang)体(ti)V区(qu)(qu)的(de)序列重(zhong)新洗牌。在DNA shuffling中，突变不限于(yu)CDR区(qu)(qu)，也(ye)包括FR区(qu)(qu)域，因为FR区(qu)(qu)域对于(yu)抗(kang)(kang)体(ti)与抗(kang)(kang)原的(de)结合也(ye)可能(neng)有(you)所(suo)贡献。这些方法所(suo)构(gou)(gou)建的(de)库的(de)容量(liang)较(jiao)大(da)(da)，工作(zuo)量(liang)也(ye)较(jiao)大(da)(da)。
相比(bi)大库(ku)的构建(jian)，小(xiao)库(ku)构建(jian)更(geng)有(you)序列针对性。在没有(you)其他信(xin)息的情况(kuang)下，人们(men)习惯优先选择对抗体重链CDR3区域(yu)进行(xing)随机突(tu)变，因(yin)为(wei)重链CDR3区域(yu)被认为(wei)通常对抗原抗体结合起关键作用；但若要真正提高亲和(he)力(li)优化的效率，还(hai)需要更(geng)多(duo)的信(xin)息以帮助人们(men)找出更(geng)精确的突(tu)变区域(yu)。
目前突(tu)变区域的(de)选择(ze)主(zhu)要是基于(yu)抗原(yuan)抗体复合物(wu)的(de)结构信息或胚(pei)系基因热(re)点(dian)（germline hotspots）的(de)预(yu)测(ce)。
1）基(ji)于(yu)抗原抗体复合物的(de)结构(gou)信息的(de)突变区(qu)域选(xuan)择
当抗体(ti)抗原(yuan)复合物的(de)结(jie)构(gou)被解析(xi)之后，我们(men)就可以(yi)得知两者相互作用的(de)位(wei)点信(xin)息，进(jin)而进(jin)行更精确(que)的(de)突(tu)变(bian)和(he)建(jian)库。
MorphoSys AG2016年发(fa)的文(wen)章[4]介(jie)绍(shao)了他(ta)们提(ti)高(gao)(gao)其自身的抗人GM-CSF抗体MOR103的亲和(he)力的工作。他(ta)们在知悉该抗体与(yu)抗原的结合方(fang)式(shi)后，对抗体的CDR-H2和(he)CDR-L3分别做(zuo)随机突(tu)变，并用噬菌体展(zhan)示的方(fang)法筛(shai)选到高(gao)(gao)亲和(he)力的序列，之后再把筛(shai)到的重链与(yu)轻(qing)链配对，得到一(yi)个新(xin)的“cross-cloned”抗体:
体(ti)外GM-CSF和(he)GM-CSFR结(jie)合的(de)抑(yi)制实验比较(jiao)了这(zhei)4个(ge)抗体(ti)的(de)效价(jia)。另外，他们(men)还分别解析了这(zhei)4个(ge)抗体(ti)与GM-CSF结(jie)合的(de)复(fu)合物的(de)结(jie)构(gou)并(bing)进行比较(jiao)，探讨了构(gou)效关系。
2）基(ji)(ji)于(yu)胚系基(ji)(ji)因热点（germline hotspots）的突变(bian)区域选择
Germline hotspots是体细胞高(gao)频突变(bian)过程(cheng)中(zhong)的(de)优先突变(bian)区域，几乎都处于CDR区域内部，经证明对(dui)抗体的(de)亲(qin)和力提高(gao)起到关(guan)键(jian)作用，因(yin)此体外亲(qin)和力成(cheng)熟时(shi)可优先考虑抗体的(de)germline hotspots。
具体的(de)做法是利用数据库来比对抗(kang)体的(de)序(xu)列(lie)(lie)和(he)抗(kang)体胚系基因序(xu)列(lie)(lie)，结合(he)序(xu)列(lie)(lie)相似(si)度(du)和(he)RGYW motifs等坐标性的(de)序(xu)列(lie)(lie)预测出germline hotspots，然后在(zai)这些热点位置进(jin)行突(tu)变，构建小的(de)库进(jin)行筛(shai)选。早在(zai)2009年(nian)，Ira Pastan课题组(zu)就发表protocol，以抗(kang)CD22的(de)单抗(kang)为(wei)例，利用germline hotspots预测和(he)噬(shi)菌体展示技术提高抗(kang)体的(de)亲(qin)和(he)力[5]。
至于引入突变(bian)的(de)(de)(de)方法，较简单的(de)(de)(de)是易错PCR，但(dan)很难达到好的(de)(de)(de)突变(bian)效果。另外一种比较流行的(de)(de)(de)就是在(zai)引物(wu)上(shang)设(she)计(ji)突变(bian)，即人工合成带有突变(bian)区域的(de)(de)(de)引物(wu)库。具体的(de)(de)(de)设(she)计(ji)方法有很多，包括(kuo)控制(zhi)突变(bian)碱基的(de)(de)(de)数目、控制(zhi)每个(ge)位点各种碱基出现(xian)的(de)(de)(de)概率等，以此来满足(zu)对库的(de)(de)(de)容量(liang)和偏向性的(de)(de)(de)需求。
2.2 筛选方法
基(ji)(ji)于(yu)库(ku)的抗(kang)体(ti)亲和力成熟与基(ji)(ji)于(yu)库(ku)的抗(kang)体(ti)初步筛选涉及的方法基(ji)(ji)本相(xiang)同(tong)，主要是利用噬菌体(ti)展示(shi)、酵母展示(shi)、核糖体(ti)展示(shi)等系(xi)统(tong)。
噬菌体(ti)(ti)展(zhan)示(shi)(shi)的(de)优(you)势在于(yu)操作方(fang)便(bian)，流(liu)程相对简易(yi)；酵母展(zhan)示(shi)(shi)的(de)优(you)势在于(yu)与流(liu)式分(fen)选(xuan)(xuan)相结合，检测和筛(shai)选(xuan)(xuan)同时进(jin)行(xing)；核糖体(ti)(ti)展(zhan)示(shi)(shi)的(de)优(you)势是系统容量(liang)较大，可用于(yu)大库的(de)筛(shai)选(xuan)(xuan)，另外可以实(shi)现(xian)库的(de)体(ti)(ti)外进(jin)化。这(zhei)些技术(shu)各(ge)有(you)优(you)劣，根据实(shi)际(ji)需要选(xuan)(xuan)择使用。
参考文献
Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: direct experimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research
Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology
Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFvwith somatic hypermutation in non-B cells. Protein Cell
Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolution of a neutralizing anti-human GM-CSF antibody. mAbs
In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. Methods MolBiol
版权(quan)声明
版权(quan)(quan)为生物制(zhi)药(yao)小编(bian)所有。欢迎个人转(zhuan)发(fa)分(fen)享。其他任何媒体(ti)、网(wang)站如需(xu)转(zhuan)载或(huo)引用本网(wang)版权(quan)(quan)所有内(nei)容(rong)须获得授权(quan)(quan)且在醒目位置处注明(ming)“转(zhuan)自：生物制(zhi)药(yao)小编(bian)”。
